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第四军医大学口腔医院口腔遗传病门诊
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人类遗传病致病基因克隆及其生物学功能研究进展
(2013/10/29) 浏览人数: 557

人类遗传性疾病(简称遗传病)是指以遗传因素作为惟一或主要病因的一大类疾病,其中遗传因素又以细胞水平的染色体畸变和分子水平的基因突变为主遗传病的群体患病率大多在1/10001/10000之间然而,因病种众多(一般估计为60008000),故这类疾病在群体中的患病人数并不低

近年来,随着遗传病诊断技术的不断改进,遗传缺陷的检出率正在不断提高;然而,由于对这类疾病致病机制的认识还很有限,影响了遗传病防治工作的有效开展为了从源头上认清遗传病的本质,就需要开展遗传病致病基因的克隆及其生物学功能研究

1遗传病的分类及基本特征根据遗传病病因的不同,通常将其分为5种类型

染色体病(chromosomal disease):指由染色体数目畸变或结构异常所引起的一类疾病其中染色体数目畸变往往是因染色体不分离所致,临床上可见整倍体畸变非整倍体畸变和嵌合体等表现形式;结构畸变则通常因染色体断裂及错误重接所致,临床上可见的表现形式有缺失倒位重复易位环形染色体等臂染色体等目前已报道的染色体病超过300种,分布在22条常染色体和2条性染色体上,其中群体发病率约在1/1000的有21三体综合征(47XY/XX+21)先天性睾丸发育不全综合征(47XXY)和先天性卵巢发育不全综合征(45XO);单基因遗传病(single gene disorder):指由单个基因突变所引起的一类疾病常见的基因突变包括碱基置换(错义突变无义突变终止密码突变)密码子缺失或插入移码突变融合基因拼接区突变动态突变(主要指三联核苷酸重复)以及大片段缺失或插入等基因突变产生的分子生物学效应包括功能缺失功能增强形成新特征以及显性负效应等常见的单基因病有分子病,如镰形红细胞贫血症和地中海贫血等;还有生化代谢异常,如因氨基酸代谢异常所致的苯丙酮尿症,因糖代谢异常所致的半乳糖血症,因脂肪代谢异常所致的黑矇性白痴等已知这类疾病有6000余种,各病的群体患病率约为1/10000,属于少见或罕见性疾病但目前仅有300余种疾病属于可治性遗传病,其余疾病的防治难度较大多基因遗传病(polygenic disorder):指由多个易感基因突变加上多种环境因素影响所致的一类疾病,也称为多因子疾病或复杂性疾病(multifactorial diseasecomplex disease)这类疾病中糖尿病高血压等为严重危害群体健康的常见病,一些先天畸形(如唇裂先天性心脏病等)也对婴幼儿的健康成长构成了威胁线粒体基因病(mitochondrial gene disorders):指由线粒体基因突变所致的疾病,该病往往与线粒体一起传递,故呈母系遗传或细胞质遗传,如Leber遗传性视神经病体细胞遗传病(somaticcell genetic disorders):包括癌症及部分先天畸形已知癌症发生需要多个原癌基因被激活多个肿瘤抑制基因被失活,而激活或失活的过程主要发生在体细胞水平的遗传物质上

2 遗传病致病基因克隆和机制研究的现状

21 遗传病致病基因克隆的策略与方法

遗传病致病基因克隆常采用以下三种策略或方法:一是依据反向遗传学原理定位和克隆致病基因该法通过运用限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphismRFLP)短串联重复序列(short tandem repeatSTR)又称微卫星DNA(microsatellite DNA)单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphismSNP)等遗传标记,先确定某一致病基因在染色体上的位置,再在候选区域内选择若干候选基因进行筛选,最后获得该致病基因的DNA序列及cDNA序列;二是采用消减杂交(subtractive hybridization)法克隆致病基因通过该法可首先获得能特异表达蛋白质的基因片段,然后进行染色体定位及致病基因的克隆三是介于两者之间的候选克隆法,包括定位候选克隆法和功能候选克隆法,其中前者是根据连锁分析和染色体定位的结果,筛选候选区域内所有结构与功能相关的基因,最终通过测序分析确定致病基因后者根据致病基因的可能功能,筛选基因库所有功能相近的基因,并从这些基因中克隆到致病基因随着人类基因组计划的完成,从整个基因组水平克隆致病基因成为可能目前常用的方法为外显子组捕获(exome capture)或外显子组测序(exome sequencing)技术,该法首先遴选到某种遗传病所特有的SNP及其所在的位置,并通过DNA测序法证实该致病基因20098月以来,已有数十种单基因遗传病的致病基因通过该法找到另一种方法为全基因组关联研究(genome-wide association studiesGWAS),该法首先从人类全基因组序列变异中筛选出与疾病相关联的多个SNP,并从关联性很高的SNP(P5×108)中筛选出与多基因遗传病相关的易感基因该法自2005年问世以来,已有1000余篇论文发表,确认了近万个遗传病的易感基因国内学者在这一领域也屡有斩获

22 遗传病致病基因功能研究的现状

遗传病致病基因生物学功能或致病机制的研究包括2个层面一是在离体(in vitro)状态下开展的研究,如利用生物信息学技术预测突变蛋白的结构与功能,利用生物化学及分子生物学技术研究突变基因对遗传信息流及信号通路的影响,利用细胞生物学技术研究突变基因产物在细胞中的定位基因突变对细胞增殖与分化的影响及细胞病理学改变等二是在体(in vivo)即采用模式生物(model organism)技术开展的相关研究常用的模式生物包括大肠杆菌酵母线虫斑马鱼果蝇小鼠等由于小鼠的世代周期短生物进化上与人类接近,胎盘形成和早期胚胎发育与人类相近,组织器官结构和细胞功能与人类相似,而且与人类基因的同源性高,区域基因排列顺序与人类相同,因此被首选为研究人类遗传病致病机制的模式生物目前,小鼠基因组改造的技术趋于成熟,已能根据研究需要建立各种小鼠模型,包括转基因小鼠(transgenic mice)基因敲除小鼠(knock-out mice)基因敲入小鼠(knock-inmice) 基因敲减小鼠(knock-down mice)利用小鼠模型可以在整体动物水平观察相关基因表达被上调下调或阻断后所产生的表型变化,也可观察致病基因被敲入后小鼠模型的表型变化上海南方模式生物研究中心已建立的小鼠医院可以全面检测小鼠模型的各种表现,包括小鼠的生长发育状况繁育能力生化代谢指标骨关节影像学分析组织病理学观察行为学变化检测等通过分析小鼠模型的各种数据,结合离体水平的研究结果,有望揭示遗传病致病基因的生物学功能此外,小鼠模型也是药物筛选的理想模型

3 遗传病致病基因克隆和机制研究的案例分析

31 FGF9基因突变导致多发性骨性连接综合征的致病机制研究

多发性骨性连接综合征(multiple synostoses syndromeSYNS)是一种常染色体显性遗传病,临床主要表现为多处关节强直或融合已报道SYNS1NOG基因突变所致,SYNS2GDF5基因突变所致,此外还存在未知基因突变的其他类型项目组在211工程(三期)经费的资助下,从青海省采集到一个共有556人组成的SYNS大家系经知情同意,对所有家系成员进行临床检查X线摄像和分子诊断,共确定12位患者通过DNA测序分析排除由NOGGDF5基因突变致病的可能性通过全基因组扫描和连锁分析将新的致病基因定位在13q11-q12上,最大LODS值为370采用定位候选克隆法对20个可能的致病基因进行测序筛选,结果发现成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9FGF9)与该家系紧密连锁序列分析发现FGF9基因第2外显子第99个密码子发生错义突变,导致编码丝氨酸的密码子突变为编码天冬酰胺的密码子(S99N),而正常家系成员及无亲缘关系的250个正常人未见突变比较基因组研究显示突变发生在FGF9的保守基序EFISIA蛋白质模拟显示突变后FGF9蛋白与FGFR3IIIc受体的结合更为紧密,改变了正常的生物学功能细胞水平研究显示FGF9WT能够促进软骨细胞增殖,抑制成骨细胞分化;FGF9S99N促进增殖的作用减弱,抑制成骨细胞分化的作用丧失,提示FGF9S99N可能通过影响关节软骨的增殖和分化最终影响骨关节的形成分子生物学研究显示FGF9基因突变失去了对MAPKWNT信号分子的激活能力,而且也减弱了与FGFR3受体的结合能力,由此导致患者的指关节腕关节腑关节肘关节以及腰椎等发生骨关节融合同时,项目组还建立了FGF9基因突变敲入小鼠模型,表型分析显示纯合子小鼠均在出生后24h内死亡,杂合子小鼠则出现尾巴弯曲(763%)和切牙错位生长(131%)等表型钼靶摄片显示小鼠卷曲的尾椎关节出现融合病理学检查显示杂合子小鼠部分尾椎关节融合,椎间盘消失,新生小鼠尾骨关节排列紊乱杂合子小鼠膝关节虽未出现关节融合的改变,但交叉韧带变粗,关节面破损,关节腔中出现脂肪细胞浸润综合上述表型,可以认为项目组已成功建立了FGF9S99N敲入小鼠模型,为进一步研究该致病基因的生物学功能及致病机制奠定了坚实的基础

32 神经管闭合不全致病基因Palladin的生物学功能研究

我国是胎儿神经管闭合不全的高发国家,每年发病人数高达10万例,约占全球的1/4常见的神经管闭合不全包括无脑儿脊柱裂等,会导致胎儿流产或新生儿死亡,严重威胁下一代的健康Palladin是一种细胞骨架蛋白,主要在胚胎期表达,参与神经发育和胚胎造血Palladin与神经管闭合不全之间的关系尚待明确为此,项目组建立了Palladin基因剔除小鼠模型,表型分析显示该基因缺失可导致所有小鼠出现神经管闭合不全,伴有内脏外露胎肝萎缩及胚胎造血功能障碍,最后导致胚胎死亡项目组还分离培养了Palladin基因剔除小鼠的胚胎成纤维细胞,体外研究发现Palladin缺失的胚胎成纤维细胞与细胞外基质的黏附功能显著降低细胞迁移障碍细胞内张力丝减弱且排列紊乱细胞内β1-integrin蛋白显著下降,表明Palladin为胚胎正常发育所必需,是维系细胞基本功能正常和胞内骨架结构稳定的关键分子,其缺失可导致神经管闭合不全研究还发现,Palladin缺失小鼠胚胎在胚胎期135145d显得苍白,胎肝出现明显萎缩,胎肝造血灶内检出大量凋亡细胞;流式细胞仪分析显示该基因缺失导致胎肝终末期造血功能障碍;胎肝组织切片及体外细胞培养发现胎肝造血过程中的一个关键单元(造血小岛)的形成由于该基因的缺失而发生严重障碍令人意外的是,造血小岛的核心细胞(主要为巨噬细胞)缺失Palladin后不能与该基因突变的成红细胞乃至正常成红细胞相互作用形成血岛;而正常胎肝巨噬细胞能与野生型甚至该基因纯合性突变的成红细胞相互作用形成血岛此外,项目组还研究了Palladin在神经细胞分化过程的作用,结果显示Palladin缺失小鼠的神经丝和神经突起的生长情况与野生型小鼠相比并无明显差别,提示Palladin并非小鼠神经突起生长所必需该项研究取得的系列成果为神经管闭合不全的防治提供了理想的动物模型由上述成果申报的人类遗传病新致病基因的克隆及其生物学功能的研究获得2012年上海市自然科学奖

尽管近年来在遗传病致病基因克隆及其生物学功能研究方面取得了明显的进步,但根据人类孟德尔遗传网上版的统计(截止2012716),在所有21309个性状或疾病中仅有3529个性状或疾病既有表型描述,又有分子机制研究的信息而已明确遗传病分子机制的只有1000余个因此,遗传病致病基因分子机制的研究及有效防治措施的建立任重而道远

作者:王铸钢 顾鸣敏

出处:《上海交通大学学报(医学版) 201209

 

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