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第四军医大学口腔医院口腔遗传病门诊
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一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
(2013/11/19) 浏览人数: 462
 

目前, DNA 碱基变异如突变或单核苷酸多态性( single nucleotidepolymorphism,SNP) 的检测方法有2 : 一是针对特定的位点合成序列特异性探针, Taqman 探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等, 用于检测已知突变; 二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等, 此类方法可用作突变筛查, 但无法明确突变性质。这2 种方法在应用上有其局限性, 如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。DN A 测序是突变/SN P 检测的金标准, 但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。2002 年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变/ SNP 检测分析的一项新技术) 高分辨率熔解曲线分析( high resolut ion melt ing ,HRM)。这种技术不受突变碱基位点与类型的限制, 可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注, 成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。

1 HRM原理

通过PCR 反应扩增出目的基因的双链DNA片段, 向反应产物中加入荧光染料, 这种染料只结合双链DNA 而不结合单链DNA。然后通过加热物理变性, 在升温的过程中DNA 双链会逐渐打开, 这样结合的荧光染料会越来越少。如果相机连续动态拍摄解链过程, 并将接收到的逐渐减弱的荧光信号通过计算机软件转换成一条曲线, 这条曲线就是熔解曲线。当PCR 扩增片段存在突变/ SN P , 扩增产物经过变性-陡然复性形成异源双链, 异源双链中突变/ SNP 位点因不匹配使双链DNA 在升温过程中提前解开, 从而与正常样本熔解曲线区分开来。实际上, 由单个碱基改变引起的解链温度差异可能不到1 e 。因此, H RM 需要精密度高的检测仪器,要求具有很高的温度分辨率。当仪器的温度分辨率达到0.02~ 0.3 e / s , 所绘制的曲线称为高分辨熔解曲线。目前使用的是饱和染料, LC GreenLC Green PlusSYT O 9 Eva Green, 这类染料有着更强的DNA 结合能力和更低的PCR 抑制作用,在配制PCR 反应液时就可加入, 反应完毕后直接送入HRM 仪进行分析, 省略了PCR 反应后的开盖处理步骤, 真正实现了闭管操作。

2 HRM技术优点

2.1 操作简便 PCR 反应前加入一种饱和荧光染料, PCR 反应后将PCR板转放在高分辨率熔解分析仪器中即可。

2.2 快速、高通量 普通PCR 反应一般只需2 小时, 熔解分析使用HR-1 仪器每个样品检测仅需1~2 分钟; 若使用LightScanner 熔解分析仪, 5 分钟内可以得到96 PCR 板中的全部样品的检测结果。

2.3 低成本 比普通PCR 反应仅多加一种饱和荧光染料, 一般情况下每个样品成本大约2 元人民币。

2.4 闭管操作 PCR 扩增后直接进行HRM 分析, 不需要对PCR 产物进行处理, 减少污染机会。

3 HRM的应用

HRM 的分辨率高, 其敏感度和特异度均优于现有的其他突变扫描方法, 适用于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。有研究显示应用质粒来验证HRM 检测单个碱基杂合突变, 发现当PCR 产物小于400 bp, 敏感度和特异度均为100% ; PCR 产物长度在400~ 1000 bp , 敏感度和特异度分别为96.1%99.4%HRM 技术现被广泛应用于突变扫描、基因分型、序列匹配、物种鉴定等。

本院实验室从2009 年开始应用HRM 技术, 目前常规用于多种单基因病的突变筛查。α-地中海贫血是我国南方人群的常见遗传病, 当夫妇的一方α-基因是东南亚缺失型( SEA ) , 如果另一方携带点突变型α-地中海贫血, 则下一代有1/4 机会生育非缺失型血红蛋白H 病患儿。这种情况下需要产前诊断, 因非缺失型血红蛋白H 病患儿多需要输血治疗。点突变型α-地中海贫血在中国人群最常见为血红蛋白Constant Spring ( Hb CS ) 和血红蛋白Quo ng Sze ( Hb QS) , 靠一般的地中海贫血筛查方法( 血常规、血红蛋白分析) 无法识别, 确诊需要分子诊断。既往使用反向点杂交技术或直接测序技术检测Hb CS Hb QS, 现已被HRM 技术替代, 检测敏感性和特异性均为100%。由于这2 种点突变只占人群的0.3% , 先经HRM 扫描, 只对熔解曲线阳性者进一步采用其他分子诊断方法证实, 大大减轻了DNA 测序压力。

应用HRM 检测的另外一种遗传病是致死性软骨发育不良I ( thanatophoric dysplasia type 1,TD 1) TD 1 多在妊娠中晚期被产前超声检查发现, 表现为长骨短小、肋骨短、胸廓狭窄等, 多为新生基因突变所致。但TD 1 至少需要与数十种骨骼系统发育异常的疾病相鉴别, 它们在超声表现上有相似之处。TD 1 是由FGFR3 基因突变引起, 目前至少已发现11 种突变类型, 其中p.R248C 突变最常见, 经研究发现, 中国人TD 1 病例几乎都检测到p.R248C 突变。在p.R248C 突变的检测上, 以往应用变性梯度凝胶电泳( DGGE) 、限制性内切酶分析( RFLP) 和直接测序等方法进行基因诊断。但这些突变检测方法存在操作繁琐、费用高、诊断周期长等缺点。应用HRM 扫描检测p.R248C 突变的敏感性和特异性均为100%。因此, 对常规产前超声检查疑为TD 1 的病例, 临床上在产前取材排除染色体疾病的同时可行基因诊断, 以便尽早明确诊断, 协助临床处理。HRM 可用于FGFR3 基因p.R248C 突变的快速基因检测。

此外, 还将HRM 技术应用于其他遗传疾病如血友病、成骨发育不全等的突变扫描。这些致病基因往往包含数十个外显子, 若采用常规DNA 测序来检测基因突变, 工作量和成本很大。先通过HRM 突变扫描, 针对异常的外显子进行测序确证,将达到事半功倍的效果。

4 HRM缺点

4.1 PCR 反应、熔解仪器、荧光染料要求较高 由于双链DNA 的熔解动力学受到很多因素的影响, 比如DNA 模板质量、镁离子含量、缓冲液组成等, 所以HRM 要求DN A 样品由同一种方法提取, 经纯化使DNA 样品浓度一致。对引物及扩增片段要求高, 常需反复实验, 验证是否适用于HRM。熔解仪器要求非常高的温度精密度和温度均一性。荧光染料不影响PCR 反应且能饱和结合双链DNA

4.2 突变扫描不能精确区分扩增片段中的不同杂合突变 有时不同的杂合突变导致相似的熔解曲线, 需进一步经混样法区分, 或小片段法、非标记探针法、Snapback 探针法进行基因分型提高分辨率。

4.3 PCR 扩增产物的长度受到限制 随着扩增片段的增加, 其敏感性及特异性降低。

5 结论

HRM 是当前最好的一种高通量突变扫描和基因分型技术。如果操作得当, 可以减少95%~ 99%的测序工作量。HRM PCR 产物无损伤性, 如果HRM 鉴定样本( 基因分型和序列匹配) 失败, 可使用原样本测序进一步鉴定, 对结果无影响。可以设想, 随着染料和仪器的更新, 这项技术还将继续迅速发展, 在医学领域发挥更多的作用。

作者:李东至

出处:《中国产前诊断杂志(电子版) 201102

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