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遗传性乳光牙本质致病基因 DSPP的突变分析
(2014/5/14) 浏览人数: 389
 

遗传性乳光牙本质又名牙本质发育不全Ò( dentinogenesis imperfecta type Ò , DGI2Ò DGI1) ( MIM125490) 是一种常染色体显性遗传病, 表现为牙齿结构异常。我们拟就新发现的一个 DGI2 Ò 家系进行牙本质涎磷蛋白( dentin sialophosphoprotein, DSPP) 致病基因的突变检测, 以证实是否有新的突变位点, 从而进一步阐明该病基因型和表型间的相互关系。

一、材料和方法

1. 研究对象: 为天津医科大学口腔医院牙体牙髓科发现的一个 DGI2Ò 回族家系, 可追溯 5 , 现存活 4 , 31 ,10 人受累, 5 例乳光牙表现, 其他患者已作修复治疗。先证者前牙切端和舌面、后牙面露出琥珀色牙本质, 4个第一磨牙牙冠至牙槽嵴水平。还有一乳牙患儿。其余 3 例患者的临床表现比先证者轻, 5例患者 X线全景片均显示髓腔和根管闭锁。家系成员无听力异常和全身骨骼病变。致病基因传递规律符合常染色体显性遗传特征。

2. 外周血 DNA的提取: 采集家系10例患者、8名健康人及1名非家系正常对照的静脉血, 提取基因组 DNA并定量。

3. 引物设计: 针对 DSPP 基因外显子 3 和外显子 4 设计引物, 进行巢氏 PCR 扩增。第 1 PCR 反应的上游外引物:5c2GGGCTGATCTAACACGTCCA23c; 下 游 外 引 物: 5c2CCTCGT2TTCTACAGGAATTCTCA23c。第2 PCR 反应的上游内引物:5c2CAAGCCCTGTAAGAAGCCACT23c; 下游内引物: 5c2TGCTTC2CAGCTACTTGAGGTC23c

4. PCR 反应和测序:将上述基因组 DNA进行 PCR 扩增。第1 PCR 反应条件为 94e 变性30s, 57e 退火30s, 72e 延伸100s, 35个循环, 72e 延伸7 min, 1% 琼脂糖凝胶电泳分离。第 1 轮产物稀释后, 行第 2 PCR 反应, 复性条件为 63e 退火 30 s, 反应后电泳分离。取第2 PCR 产物, PCR 内引物为测序引物直接测序。

5. RsaÑ 限制性内切酶酶切鉴定: 将酶切反应体系混匀后 37e 消化 3 h, 2%琼脂糖凝胶电泳分离。

二、结果

1. 测序结果: 突变个体显示 DSPP 基因外显子 3 的第3658 位核苷酸发生 Cy T 的置换, 导致编码第 45位谷氨酰胺的密码子突变为终止密码子。

2. RsaI 限制性内切酶酶切电泳结果: 正常个体经 RsaI 酶切和电泳分离后得到 2 条小带, 而突变个体破坏了 RsaI 的识别序列, 电泳后只有一条大带。对于杂合子出现 3 条带,1条大带和 2 条小带。10 例患者 DSPP 基因发生了终止突变, 所有患者在该位点均为杂合子。

三、讨论

目前证实牙本质涎蛋白( dentin sialoprotein, DSP) 和牙本质磷蛋白( dentin phosphoprotein, DPP) 是由一个基因 DSPP 编码的两种蛋白质, 5个外显子组成, DSP 由外显子 124和少部分第 5 外显子编码, 大部分第 5 外显子编码 DPP。本研究同我们前一个家系的研究结果一致, 且两个家系均为回族,该家系也是 DSP 区外显子 3 3658 位核苷酸发生了无义突变。而 Xiao 等报道的 3个中国 DGI2Ò 家系 DSPP 分别发生了3个不同的点突变。综合 5个家系的研究结果, 发现其突变位点均集中在 DSPP 外显子2 3 DSP , 可能导致DSP 部分表达和 DPP 表达缺失, 而正常牙齿 DPP 在牙本质非胶原蛋白中含量占50%, DSP仅占5%, 且由于DPP 高度磷酸化, 能结合钙, 因此 DPP 表达减少或缺失可能严重影响牙本质的矿化的程度; 同时提示不同的突变位点造成不同的表型, 可能显示了DSPP 基因的多效性。

出自中华口腔医学杂志

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