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遗传病的基因诊断
(2014/5/23) 浏览人数: 518
 

目前, 我们对遗传病的诊断主要依靠病史、家族史(家系分析)、临床表现、临床检验及其他辅助诊断方法进行。基因诊断是采用各种DNA分析技术, 对先证者和家系进行分析的方法, 确定与疾病相关的基因、基因的突变类型或与致病基因紧密连锁的多态性标记, 达到确诊患者的疾病、检出家系中突变基因的携带者的目的, 进而进行遗传病的产前诊断, 预防患儿出生。

一、须说明的几个问题

人们常常认为用基因分析的方法是遗传病诊断的最简便的途径, 这实际上是一种误解, 其实遗传病的基因分析是以临床诊断为基础的, 没有准确的临床诊断,基因分析便无法进行, 这是因为存在以下几个问题:

1遗传异质性: 有些遗传病比较容易确诊, 如地中海贫血、血友病A、肝豆状核变性、苯丙酮尿症, 从临床水平即可明确诊断, 对于这类遗传病, 相关的致病基因很明确, 只有一个; 而有些疾病情况则比较复杂, 如脊髓小脑共济失调、成人型多囊肾、结节性硬化症等, 相关的致病基因有多个, 遗传方式可能多种(常染色体显性、常染色体隐性或X连锁) , 这些基因中任何一个发生突变, 皆可产生同样的临床表型, 这种现象我们称之为遗传异质性, 对于这类遗传病, 要进行基因诊断首先必须确定相关的致病基因(通过家系连锁分析确定相关基因的多态性连锁标记是否与疾病表型共分离)。对于多因素或多基因遗传病, 情况则更为复杂。

2基因突变的多样性: 确定了相关基因、接着的问题是相关的基因发生了什么样的突变?归纳起来, 基因突变在DNA 上的表现为两种: (1)DNA序列中核苷酸数目的改变, 包括缺失、插入和动态突变; (2) 核苷酸的取代。一些遗传病只有一种基因突变类型, 如脆性X综合征、Huntington病、强直性肌营养不良, 为动态突变,是基因中特定的多态性三核苷酸重复序列的过度膨胀所致; 有些遗传病的基因突变以缺失为主, A地中海贫血、Duchenne型肌营养不良; 有些基因突变则完全由核苷酸取代所致, B地中海贫血、苯丙酮尿症。大的缺失ö插入突变、动态突变一般比较容易检测, 而小的(数个核苷酸) 的缺失ö插入和核苷酸取代的检测比较难。缺失可发生在基因不同的区域; 核苷酸取代可发生在不同的位置, 并且一个基因的致病突变有多种至数十种突变类型。在一个具体的家系中确定特定的基因突变需要复杂的分析过程, 尤其是核苷酸取代的“点突变”, 除非在一个群体中只有少数几种突变。要确定这种突变的细节是相当费事的, 有时还会遇到“未知突变”的情况。

3基因诊断的基础是临床诊断: 除了缺失ö插入突变、动态突变及某些单基因病, 通过PCR 及相关技术能够直接检测出突变之外, 对大多数遗传病在明确其基因突变类型及分布之前尚不能进行基因水平的鉴别诊断, 至多只能依靠多态标记进行家系连锁分析, 确定疾病相关基因, 确定突变基因携带者并进行产前诊断。因此在进行基因诊断前一定要注意临床诊断的准确性。如果临床诊断不准确, 起步错了, 以后所有的分析结论将可能是错误的。进行基因诊断的门诊和实验室在接收外院转诊的患者时, 一定要重新检查确诊, 不能盲目接受别人的诊断结果。

二、基因诊断的常用方法

1Southern杂交: 这是最经典的基因分析方法, 它包括下列分析步骤: (1) 基因组DNA提取, (2)DNA 限制性内切酶酶解基因组DNA, (3) 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段, (4)DNA片段原位碱变性, (5) 凝胶中单链DNA Southern印迹转移, (6) 探针标记, (7) 分子杂交, (8) 放射自显影或其他显示信号的方法。应用Southern印迹杂交可进行缺失ö插入检测和限制性片段长度多态性(RFLP) 连锁分析。缺失ö插入的检测: 染色体DNA 发生缺失ö插入时,Southern印迹图表现为DNA片段的消失、增加和()片段长度改变。缺失时, 杂交带消失、变小, 但偶尔增长;发生插入突变时, 一般是杂交片段增长, 或杂交片段增加。在单纯长度发生改变时, 应与酶切位点本身的改变鉴别。如果用其他酶进行Southern印迹杂交,仍显示片段长度改变时, 多为缺失ö插入突变。限制性内切酶酶切片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism, RFLP) 分析: RFLP常简读为限制片段长度多态性。等位基因上DNA 序列碱基差别若发生在限制酶的识别序列当中, 导致识别位点的增加或消除, 从而等位基因显示不同长度的杂交片段。切点增加时表现为杂交片段变小, 或出现两个较小的片段, 切点减少时杂交片段增长, 或两个小杂交片段消失的同时出现一个大片段。基因组DNA中串联重复序列所含的重复单元数目不同时, 也表现为等位片段长度的差别。RFLP除可用Southern 印迹方法检测外, 还可用限制酶酶解PCR扩增产物的方法。21 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR ) : PCR及相关技术是一项快速、准确地从少量DNA 样品中扩增特异DNA片段的方法。其原理是, DNA 聚合酶作用下引物延伸反应, 每次合成的DNA链可作为下一轮聚合酶延伸反应的模板。这样, 随着变性2复性2延伸的反复循环, 产生的DNA拷贝数以指数倍增, 如果循环n, 理论上可获得2n拷贝。PCR产物长度一般为2kb左右, 使用改良的聚合酶及反应系统, 扩增的长度可达到数十个kb。多重PCR: 如果需要扩增的DNA 片段较多, 若引物退火温度相近, 并且所覆盖的区域不重叠, 可在同一反应体系中进行PCR, 同时扩增多个DNA 片段。这种多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失。或在PCR反应系统中加入标记物, PCR产物进行ASO探针的反向杂交, 进行点突变直接检测。突变等位基因特异PCR:PCR引物对中一个引物为等位基因特异的, 3′端为突变核苷酸, 分别与正常和突变序列互补。控制PCR条件, 只使特异的等位基因得以扩增。分正常和突变的两组进行, 结合多重PCR可同时检测某一基因的多个点突变, 经琼脂糖凝胶电泳即可确定个体的基因型。扩增片段长度多态性: PCR扩增片段中间含有STR 序列, 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染色, 可检测扩增产物的长度多态性。逆转录(RT) 2PCR: RT 2PCR 是一种以mRNA为起始物的PCR, mRNA先经逆转录酶合成cDNA制备PCR 模板。这项技术只需少量的mRNA 就可以进行扩增, 额外优点是, 它除可直接检测基因的缺失ö插入外,还可检测前体mRNA 加工过程的异常。等位基因特异的寡核苷酸(allele specific oligonucleotide, ASO ) 探针斑点杂交: ASO探针杂交是最早用来检测点突变的方法。用人工合成的19个碱基左右长度的寡核苷酸, 分别针对正常和突变的等位基因, 在严格的杂交洗脱温度下获得特异性杂交结果。使用四甲胺盐酸盐(TMAC) 杂交系统, 洗脱条件只与ASO的长度有关, 而与ASO的碱基组成无关, 这样可将同一基因的不同突变的A SO 探针固定在滤膜上进行反向杂交, 通过标记待测个体DNA PCR 扩增产物, 一次杂交即可鉴定待测个体的基因型。目前正在发展的DNA芯片技术就是这一原理与F ISH 技术的结合。PCR产物DNA 单链构象多态性( single strand conformation polymorphisms, SSCP)或双脱氧指纹法(dideoxy fingerprinting, ddF) 分析: SSCP是指等长的单链DNA 片段因核苷酸序列的差别而产生的构象差异, 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中表现为电泳迁移率的差别, 根据单链条带位置的改变判断某个体是否存在特异的突变。不是所有的核苷酸序列改变都引起单链构象的改变, 因此SSCP方法还不能鉴别所有的突变。ddF 是将双脱氧末端终止法与SSCP法相结合, 通过一种双脱氧核苷酸产生异质性的(长度不一) 单链DNA, 使其中长度合适的DNA 片段显示SSCP 改变。PCR 产物变性梯度凝胶电泳(denaturing gradientgel electrophoresis, DGGE) 分析: DGGE 通常采用尿素甲酰胺浓度梯度, 电泳在衡温水浴(> 30) 中进行。正常等位基因与突变等位基因因核苷酸组成不同而解链温度(即解离强度) 不同, 电泳过程中DNA 逐渐由低强度进入高强度, 解离温度较低的DNA 片段先达到其解离强度(变性梯度) 而解离成局部单链, 泳动减慢。常在引物的5′端增加40 bp 左右的CG 重复片段(即“CG夹”) , 使DNA 分子保持部分解离的状态。在PCR 后将待测个体的扩增产物与正常个体的扩增产物混合, 加热变性然后缓慢复性形成杂交双链, 然后再进行DGGE分析, 可进一步提高检测率。多重等位基因特异性诊断测定(MASDA) : 其原理是将许多基因的PCR 扩增产物结合在固相支持物上,在同一TMAC 杂交体系中, 用该人群中相应致病基因的所有突变的ASO探针(标记)进行杂交, 杂交信号阳性的斑点剪下来洗脱出探针, 经化学切割或探针特异认定测序, 通过PA GE 电泳获得探针的“指纹”, 从而确定是什么探针发生了杂交, 即该个体携带什么突变。用这种方法可一次检测某个体携带多少个突变基因, 在一张杂交膜上可同时进行数百人的检测。

三、基因诊断的策略

不同类型的突变有不同的诊断途径。对基因突变已知的遗传病, 一般采用直接检测法; 突变未知或突变已知但突变类型较多时, 用多态性连锁分析。对于具体的一个家系, 首先通过临床资料、家系分析, 确定是什么遗传病, 何种遗传方式, 然后确定基因分析的途径。

1基因诊断的取材: 基因分析的材料是DNA , 是从人体组织的有核细胞中提取的遗传物质, 一般从外周血中分离, 也可从口腔粘膜、发根毛囊细胞分离。进行基因分析时一般需采集核心家系成员(先证者及其父母) DNA。进行基因携带者分析时, 采集与患者、携带者有血缘关系的一级亲属样品。

2多态性连锁分析: 多态性连锁分析是应用核心家系成员的DNA进行的, 以确立致病基因与所在染色体多态性位点的连锁相, 从而确定受试者的基因型。常染色体遗传病患者去世之后不能进行连锁分析; X连锁的遗传病一般只需母亲和患儿, 若患儿已死亡, 可用正常的男性(同胞或舅舅) 确定母源的正常基因的染色体标记。多态性位点与基因连锁越紧密所得结果越可靠;杂合率越高应用价值越大。通过PCR 方法检测的短重复序列(STR) 的扩增长度多态性, 是最常用的遗传标记, 其优点是(1)DNA用量少, (2) 多态性信息量高,( 3) 检测时间短、费用低, (4) 无需同位素。为了提高分辨率, 常分析多个位点即进行单体型连锁分析。致病基因(或致病突变位置) 与多态性位点之间发生染色体交换, 将会破坏连锁相, 个体的基因型无法判断。在产前诊断时, 必须考虑到因交换所导致的误诊的风险。对于突变类型较多的遗传病, 从临床角度出发, 并不需要鉴定基因的突变类型, 也可用连锁分析确定家系成员的基因型, 简化分析途径。

3直接检测法: 是指直接检测基因的致病突变的方法。如(1) 基因或基因片段的缺失或插入、动态突变(三核苷酸重复序列的扩增所致) , 应用Southern 印迹杂交、PCR 方法进行分析。在Southern 印迹图上表现为片段长度的改变(Southern 印迹分析) , 在用PCR方法进行分析时, 表现为相应扩增片段长度改变或不扩增(PCR 及相关技术)(2) 核苷酸取代、缺失或插入造成的“点”突变, 应用PCR 及相关技术进行。若应用全套的ASO探针的反向杂交或MASDA , 则可一步完成检测。(3)DNA 芯片技术是最有效的途径, 但目前尚未能解决交叉杂交这一难题。

四、产前基因诊断

进行产前诊断前, 首先要明确诊断, 进行核心家系的预分析, 明确基因突变的类型和区域, 从而确定产前诊断的方案, 以便使用有限的胎儿DNA 样品进行有的放矢的分析。如果万不得已, 事先不能进行这种准备工作, 也应在进行胎儿取材的同时采集先证者(或父母)的血样, 确定了该家系的突变基因类型, 再着手胎儿检材的分析。X2连锁的隐性遗传病(DMDö BMD、血友病) 中有相当比例的病例(约占1ö3 ) 是由于新生突变引起, 表现为无家族史的散发病例。在这些散发病例中, 新生突变可发生在不同的世代层次上: 有些突变发生在患儿本身, 即母亲的生殖细胞在减数分裂过程中发生突变,其母并不是携带者; 有些母亲的生殖细胞是嵌合体, 是生殖细胞在有丝分裂过程中发生的突变, 只是部分卵母细胞携带突变的X 染色体, 再次妊娠生育患病男孩的风险取决于突变细胞的比例, 而生殖细胞中突变细胞的比例又取决于突变发生的早晚; 同理, 外祖父的生殖细胞也可能是嵌合型, 在这种情况下除母亲为携带者外, 母亲的姐妹也可能是携带者; 有些突变发生的时间可能更早, 在前几辈就发生了, 只不过在这个家族中没有表现出来。因此从患儿本身而言, 严格意义上的新生突变所占比例不大, 在这些家庭中再发风险很高, 应对散发病例进行产前基因诊断, 确定胎儿是否获得风险X 染色体。基因诊断取材的准确性(包括取材方法、时间、材质等) 至关重要, 产前诊断的误差常常由于材料的污染。采集胎儿样品有多种途径, 常规的有绒膜绒毛活检、羊膜腔穿刺、胎儿脐带血穿刺; 从孕妇外周血中分离胎儿网织红细胞的方法尚在探索中。首选采集胎儿绒毛。采集绒毛组织一般以妊娠89周为宜。一般在B超的指示下进行, 抽取的绒毛约1030mg, 经挑选剔除蜕膜后提取DNA。其优点是取材时间相对较早, 取材量相对多、质量好, 万一取材失败, 还可在晚些时间取羊水细胞补救。羊膜腔穿刺最合适的时间是妊娠1517周进行, 此时羊水比较多, 一次成功率高(98% 以上) , 羊水中活细胞的比例较多(20% ) , 因此相对安全,提取的DNA 质量也好。羊膜腔穿刺应在B 超监视下进行, 以确定胎盘的位置。血性羊水不宜直接用于DNA分析, 通过羊水细胞培养可除去母亲血细胞的污染。在孕妇外周血中存在少量的胎儿细胞, 一般分离收集胎儿网织红细胞, 先用密度梯度离心分离网织红细胞, 然后用抗胚胎血红蛋白抗体识别胎儿网织红细胞, 收集这些细胞提取DNA 进行基因分析。

黄尚志《中华儿科杂志》

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