学院主站  ENGLISH
口腔罕见病与遗传病咨询网专家热线 :029-84776169 84776173
站内搜索:
网站简介
口腔罕见病与遗传病网是针对一些罕见口腔疾病、未确诊的疑难和复杂性口腔疾病、以及遗传性口腔疾病提供医疗咨询或科普宣传的公益性网站。遗传性的口腔颌面部疾病种类繁多,可单发于牙、口腔、颌面和颅面等,或作为全身疾病的局部表型而存在。目前国内外关于罕见口腔疾病和遗传性口腔疾病的信息量相对较少,本网站聘请了一些国内外知名专家,免 [详细>>]
  □ 联系我们
第四军医大学口腔医院口腔遗传病门诊
地址:西安市长乐西路145号
电话:029-84776169
门诊时间:每周二上午 8:30~12:00
  首 页 >> 正文
基因定位技术在遗传病诊断中的应用
(2014/8/2) 浏览人数: 808
 

在早期的遗传学分子诊断中主要依赖于Southern Blotting寡核苷酸杂交等技术1985 Saiki 等首次描述聚合酶链反应(polymerase chain reactionPCR)以来PCR 技术因为其灵敏特异省时省力等诸多优点而受到了人们的高度重视已经应用于生物医学和化学等基础研究的各个领域并且成为医学临床和法医学研究的强有力分析工具之一[1-3]然而近几年来研究者们不再满足于得知某一特异DNA 序列的存在与否他们更着眼于对其进行精确的核酸定量尽管把PCR 作为一种定量的工具在技术上还面临着一些挑战荧光PCR基因定位技术是近十余年来兴起的一种分子生物学技术与其他定量方法相比具有灵敏简便快速不需使用放射性同位素的特点在基因表达传染病和遗传病的诊断等方面迅速得到了广泛应用

1 荧光PCR

基因定位技术的原理荧光PCR 定量技术的主要原理为PCR 通过化学方法在引物的5端通过共价方式连接一个荧光分子由于在进行PCR 引物和待扩增模板5端的碱基不需要完全匹配荧光PCR 引物和普通PCR 引物一样能够对待测模板进行指数扩增扩增完成后根据PCR 的产量将荧光PCR产物直接或按一定比例稀释后和内标载样缓冲液混合在自动测序仪上进行电泳在自动测序仪内激光的激发下PCR 产物上的荧光分子发出固定波长的激发光被仪器内的光电管捕获根据PCR 产物从开始电泳到经过光电管的时间测序仪自动计算出相应产物的实际碱基数不同泳道之间电泳速度的差别通过各产物内混合的内标校正同时测序仪也自动标出相应产物的荧光强度该数值就是荧光PCR定量技术对模板进行定量与定位的基础与非定量PCR 分析方法不同荧光PCR 的操作程序有助于评估污染的情况即测出污染的程度即使阴性对照产生了正的信号只要这些信号比实验样品的低得多依据这样的结果至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的[4-6]在一定程度上荧光PCR 消除了普通PCR 过于敏感假阳性率高的缺点荧光PCR 常用于研究发病机制估计病毒的负荷量监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等通过对靶基因量的检测将其与疾病的临床表现临床分型以及各种标志酶的值联系起来为疾病的诊断和药物治疗监测提供科学的依据目前该技术已广泛应用于多种遗传病的诊断和产前筛查如地中海贫血儿童型脊肌萎缩症杜氏/贝氏肌营养不良胖骨肌萎缩症和各种染色体病等

2 荧光PCR 基因定位技术在遗传病诊断中的应用

2.1 α 地中海贫血中的诊断作用

1988 Chehab 用两对引物同时扩增α 珠蛋白和β 珠蛋白基因并在这两对引物上分别标记上罗丹明和荧光素在紫外线的照射下罗丹明产生红色荧光而荧光素产生绿色荧光在同一循环条件下PCR 完成后通过离心将扩增产物和游离引物分离根据扩增后产物颜色直接判断基因的缺失情况[7]如产物为桔红色则说明α β 珠蛋白基因都得了扩增如果产物为绿色说明α 珠蛋白基因缺失只有显绿色荧光的β 珠蛋白基因得到了扩增2.2 DMD/BMD 中的应用

DMD/BMD(杜氏/贝氏肌营养不良症)是最常见的致死性神经肌肉遗传病在男性中其患病率约为1/3 500x 连锁隐性遗传其中73%为缺失或重复突变新生突变占所有患者的30%由于x 染色体的随机失活比例不同40%DMD 携带者不能通过血清CPKH 活性诊断1992 schwartz将荧光PCR 应用于该病的携带者诊断他们采用荧光引物和测序仪分析位于肌营养不良基因内部的4 CA 重复序列测序仪可以鉴别2 个碱基对长度的差异能够为连锁分析提供更多的信息[8]在以下情况时连锁分析有时不足以对携带者进行判断CA 重复不能提供信息家族成员不全新生突变或者嵌合体造成的连锁分析失效因此他们还采用荧光PCR 直接扩增肌营养不良基因外显子并用测序仪定量分析产物将结果和连锁分析一起作为判断携带者的依据通过以上方法他们对43 名可疑携带者进行了诊断

2.3 PGD 的应用

植入前诊断(PGD)只能获得非常有限的模版而荧光PCR比溴乙锭染色要敏感1 000 因此荧光PCR 在植入前诊断中的应用已经有较多的探索等位基因失扩增(ADO)和污染是植入前诊断所面临的两个主要问题因此PGD 需要检测致病基因和连锁分析进行联合判断但是限于取材PGD只能提供一次PCR 的模版荧光PCR 由于高灵敏度和分辨率适合对少量模版进行多重PCR 扩增在一个体系中同时完成对疾病基因的检测和连锁分析Joycec 采用荧光多重PCR 6 种遗传病强直性肌营养不良(DM)囊性纤维(CF)脆性X 综合征神经纤维化2 型和颅面成骨不全症进行了植入前诊断在进行PCR 的过程中都同时扩增了一个多态位点以确定被扩增细胞的来源以及排除污染[9]对于显性遗传病多态位点还能够减少ADO 可能带来的误诊在他们进行的研究中14 次妊娠进行的植入前诊断都得出了明确结论其中13 例进行了胚胎移植另有1 例没有检测到正常胚胎总之PCR 技术在定量与定位领域中的应用已经逐渐由实验室中的探索发展成为理解复杂的生物本质的一项关键技术毫无疑问在不久的将来荧光定量PCR 技术将以其精确的定量简单迅速的操作合理的成本在分子生物学实验医学特别是临床医学领域中得到更加广泛的应用

李凌春

 

友情链接: 第四军医大学  中国人民解放军口腔医学研究所实验仪器中心  中华口腔医院网  兰州大学口腔医院  口腔图书馆  西京医院  第四军医大学口腔医学院  第四军医大学口腔医院医疗咨询网 
版权所有:第四军医大学口腔医学院
地址:西安市长乐西路145号  电话:029-84776169 029-84776173