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第四军医大学口腔医院口腔遗传病门诊
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遗传病基因诊断的途径(一)直接监测
(2016/2/23) 浏览人数: 192
(1)应用基因探针或PCR进行缺失型基因监测
       部分α地中海贫血和三分之二以上的杜氏及贝氏进行性肌营养不良(DMD及BMD)是整个基因或基因片段的缺失造成的。应用基因探针(基因组DNA或cDNA探针)进行Southern印迹杂交,如果某些杂交片段消失或片段长度改变(不是由于限制酶识别位点的改变造成的RFLP),即可判定受检者有基因缺失。
       应用近年来发展起来的PCR技术,也可进行缺失基因的监测。根据缺失发生区域的DNA序列,合成一对引物进行基因扩增(反应体系中必须包含有另一无关DNA片段的扩增引物,作为反应是否成功的内对照),通过凝胶电泳检查,如果没有扩增片段,便说明该基因或该DNA片段缺失,对α地中海盆血中的Hb Bart水肿胎儿的产前诊断和DMD/BMD的产前基因诊断都是应用此法进行。
(2)造成特异限制酶切位点改变的突变基因的监测
       有时,某些“点”突变(一般为单个核苷酸的取代或少数几个核苷酸的缺失或插入)正好影响了某种限制酶的识别位点(丢失或增加),对这些与基因突变相关的酶切位点的改变,可用来进行突变基因的直接监测。例如β珠蛋白基因密码子6处有一MstⅡ的识别位点(CC↓TGAGG),而在HbS病人的β珠蛋白基因,因其密码子6由GAG(谷氨酸)突变为GTG(缬氨酸),破坏了MstⅡ的识别序列。使得正常的两个杂交片段(1.15kb,0.2kb)消失,而出现一个异常的1.35kb(1.15+0.2=1.35)片段。许多实验室应用β-S基因的这个特异标志,直接用MstⅡ酶解β珠蛋白基因相应区域的PCR产物进行HbS病的产前基因诊断。
(3)突变位点特异性监测——ASO探针斑点杂交
       绝大多数“点”突变不改变酶的识别位点,但经DNA序列分析明确基因的突变的细节之后,可人工合成针对突变位点的特异寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO)探针,进行突变基因的直接监测。ASO探针的长度一般为19个碱基,分别与被测定的突变所在区域的正常和异常DNA序列互补。在一定的杂交和洗脱条件下,只要有一个碱基不匹配,就不能形成稳定的杂交链,正常探针只能与正常基因序列杂交而不能与突变基因的序列杂交,反之亦然。1983年Conner等首先应用ASO探针进行镰形细胞贫血的基因监测,现在已广泛应用于β地中海贫血及其他遗传性疾病的基因诊断。
       PCR技术的发明使ASO探针的使用更加快速简便。用PCR产物进行斑点杂交,不仅降低了同源序列的背景干扰,而且降低了对探针放射强度的要求。可以用非放射性物质进行探针标记,操作安全,并且不受同位素半衰期的限制。目前对β地中海贫血、经典型PKU等基因的诊断,都是应用此途径。
 
 

摘自:百科文库

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