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遗传病基因诊断的途径(二)间接监测
(2016/3/21) 浏览人数: 203
间接分析监测致病基因——RFLPs连锁分析
 
    进行限制酶切片段长度多态性(RFLP)连锁分析,目前还是施行基因诊断的主要手段。对于遗传性疾病,目前了解其病因的只是其中的一小部分。即使对那些已经知道了结构基因的遗传病,由于其致病突变的细节(即核苷酸序列的改变)一时还不了解,还不能合成相应的寡核苷酸探针进行PCR/ASO监测。更不用说那些目前连其遗传缺陷的生化机理尚不明确的遗传性疾病了。对于这一类基因缺陷的监测,只能通过间接的途径,即应用RFLP连锁分析进行基因诊断。
一般说来RFLP分析所监测到的DNA多态性通常是中性突变,与基因的致病突变之间不存在连锁不平衡性,因此一个多态位点存在与否并不说明基因是否异常。只有在特定的家系中才具有一一对应的关系。
    多态性位点在基因连锁分析中的应用价值,除了它与致病突变之间连锁的紧密程度以外,还与它的杂合频率有关。连锁越紧密所得结果越可靠;杂合频率越高应用价值越大。我们用多态性信息量(polymorphism information contents,PIC)来衡量,PIC是指某一家系可以利用RFLP作为遗传标志进行基因连锁分析的概率;就整个群体而言,它是指在群体中利用这些RFLP进行基因诊断的诊断率。
    有时单单分析一个多态性位点,还不能将某一家系中的致病基因所在染色体与正常染色体区分开来,必须分析多个位点的状态,综合起来才能获足够的信息。我们将一条染色体上两个或两个以上与致病基因密切连锁的多态性位点状态的组合叫作染色体单倍体型(haplotype)。
    无论是何种遗传性疾病,只要有与之密切连锁的RFLP位点(基因本身或邻近的DNA序列),便可应用核心家系成员(先证者及父母)的DNA进行RFLP分析,确立致病基因所在染色体与RFLP位点状态的连锁关系。但只有在那些连锁关系明确、正常与异常染色体能够区别的家系中,才能对家系成员进行症状前或产前基因诊断。
 
   (1)应用基因探针进行RFLPs分析
    应用基因探针(基因组DNA或cDNA探针)所监测到的RFLP位点在基因的内部或基因附近,它与基因突变位点之间连锁非常紧密,通常情况下很少发生重组(除非基因本身非常庞大,如抗肌萎缩蛋白基因,2300kb),因此非常可靠。
DNA序列已经明确的基因内或旁侧序列中的酶切位点的多态性状况还可以用PCR方法来监测。PCR扩增后用相应的限制酶来酶解扩增产物,通过琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段是否被酶解成小片段;或者将PCR扩增产物进行ASO斑点杂交判断基因座的状态。
   (2)应用染色体DNA片段作探针进行RFLPs分析
    除了基因探针之外,还有一些探针是基因组DNA片段。这些从基因组文库中分离获得的DNA片段,在确定了其能监测出某些限制酶的RFLP后,便可用作探针的候选者。经过染色体定位,大致判定其是否与目前已知的遗传性疾病有连锁关系,然后再通过对此遗传性疾病家系的RFLP连锁分析和优势对数计分(Lod score),确定是否密切连锁。
    通过RFLP连锁分析,还可进行反向遗传学的研究,即寻找那些目前尚未获得的致病基因的DNA序列及其基因产物。某些遗传病的致病基因(进而正常基因)就是通过这个途径被揭示出来的,如DMD/BMD、囊性纤维变。
    PCR/ASO分析方法与RFLP连锁分析比较,它具有直接、简化、快速、不需家系分析、用材少等优点,更适用于产前基因诊断。但要对一种遗传病的诊断达到如此的地步,要经过一段漫长而曲折的路。对于遗传病的基因分析,总是先从临床家系分析入手,了解它的遗传规律,通过与其他遗传标志的连锁关系或伴随发生的染色体缺陷,进行基因的染色体定位,再从染色体基因图上寻找合适的连锁的RFLP探针,进行染色体步行(chromosome walking)或染色体跳跃(chromosome jumping),获得新的连锁更紧密的RFLP探针,最后获得基因DNA片段本身。随后再进行DNA或相应的cDNA序列分析,明确基因的细微结构及突变基因的致病突变细节,到此才有可能合成相应的PCR引物和ASO探针(或者监测基因内或近旁的RFLP位点用的PCR引物及探针)。才有可能简化基因分析的程序。
 

摘自:百科文库

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