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X染色体连锁智力障碍——PHF8编码一种组蛋白H4K20/H3K9的脱甲基酶
(2016/7/18) 浏览人数: 378
X染色体连锁智力障碍——PHF8编码一种组蛋白H4K20/H3K9的脱甲基酶,并且调节斑马鱼大脑及颅面发育。
 
X染色体连锁智力障碍(XLMR)是一类位于X染色体上的基因发生突变引起的先天性智力障碍, XLMR 约占所有先天性智力障碍的15%。依据除了智力障碍外是否有其他生理方面的缺陷, XLMR分为两类: 综合征型和非综合征型。约1/3 的患者为综合征型,除了智力障碍外, 还在颅面部,肌肉或代谢上有异常或者缺陷。
 
PHF8:PHD锌指蛋白8,是近年来新发现的一种组蛋白去甲基化酶,在体内通过对组蛋白的赖氨酸残基去甲基化来调节基因的表达
JmjC家族的成员之一, 具有JmjC结构域和PHD锋指结构域, PHD功能结构域特异性识别并结合H3K4me2/3核小体位点,通过JmjC催化结构域,对靶基因转录起始位点(TSS)部位相关的组蛋白去甲基化,进一步调控基因的 转录活性
 
染色质是DNA的贮存场所,其基本结构元件是核小体。核小体由四种核心组蛋白(H2A,H2B,H3和H4)和与之缠绕的DNA共同组成。每个核心组蛋白的N端都游离于核小体之外,N端的精氨酸、赖氨酸等位点可被甲基化修饰
 
甲基化修饰在调控染色体的动态结构及其转录功能上发挥重要的作用。组蛋白甲基化对基因的表达、异染色质的形成、X-染色体失活、DNA的修复和细胞的行为、命运等有重要的作用
组蛋白的甲基化常发生在赖氨酸残基或是精氨酸残基上。每个赖氨酸有3种不同的甲基化状态,即一个甲基(一甲基),两个甲基(二甲基)或三个甲基(三甲基)
H3K9me1/2
H4K20me1
图1:体外实验证实PHF8 KIA1718对组蛋白H3,H4的去甲基化作用
 
A: PHF8的基本结构模式图。PHF8蛋白具有JmjC结构域和PHD锋指结构域。JmjC是催化结构域,PHD锋指结构域是结合结构域,KIA1718与PHF2是两个已知的组蛋白脱甲基酶,他们都具有相似的结构域。
B: 构建质粒转染细菌,提取纯化相应的蛋白。以核心核小体作为底物,与纯化出来的蛋白进行体外去甲基化反应,反应的产物经过western blot分析后,检测不同组蛋白修饰的水平。
 
PHF8 和KIAA1718 具有去除组蛋白 H4K20me1 ,H3K9me1/2 and H3K27me2 的甲基能力
 
F279S是突变体:根据病人的突变位点做的突变体
突变体H279S使PHF8丧失了酶活性,不具有去除组蛋白甲基的能力。说明这个位点对于PHF8的脱甲基酶活性是至关重要的从而引起智力缺陷。
 
C-H: 质谱分析法同样得到了一致的结果:这是液相质朴相结合做的实验
m/z:质子数/电荷数的比值,一般质谱的质量范围是用质荷比来判断的。将核小体分别用转染获得的对照及PHF8进行处理,然后分别标记同位素丙酸甘D0和D5,使两个样本的荷质比相差2.5,从而在坐标轴上区分。这些同位素标记是与甲基化的尾巴结合的,PHF8进行处理后的发现H4K20me1 ,H3K9me1/2 and H3K27me2 的峰值变低即PHF8 和KIAA1718 具有去除组蛋白 H4K20me1 ,H3K9me1/2 and H3K27me2 的甲基能力
 
图2:染色体免疫共沉淀测序技术 检测PHF8 H4K20me1, H3K9me1 and H3K9me2的调控
A: PHF8  TSS附近染色体免疫共沉淀测序信号分布图:对PHF8进行染色体免疫共沉淀,针对转录起始位点进行高通量测序,在研究转录因子是人们经常关注Tss周围的峰的位置及信号强度,可以看出在TSS附近2kb区域峰较多。B: PHF8基因不同表达量的 CHIP-seq图,根据tags浓度高低分为10类。
 
染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
 
ChIP的一般流程:
甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析。ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析。
ChIP-Seq:对富集得到的DNA片段进行高通量测序。获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
 
 
染色体免疫共沉淀测序技术来研究PHF8对组蛋白甲基化调控,富集峰图
 
C/E/G: 针对PHF8转录起始位点设计的siRNA, 及control siRNA, 分别转染HeLa细胞,分别用要检测的组蛋白抗体进行染色体免疫共沉淀,最终获得的富集得到的DNA-片段进行高通量测序,
分析PHF8tss 附近信号分布
发现PHF8被沉默以后,组蛋白H4K20me1 and H3K9me1 信号增强。说明PHF8调控转录翻译是通过对组蛋白H4K20me1 and H3K9me1的脱甲基化。
D/F/H: 转染针对非转录起始位点设计的siRNA,发现PHF8被沉默以后H3K9me2的表达量升高。组蛋白H3K9me1 or H4K20me1没有变化。说明PHF8对非转录起始位点的调控是通过对H3K9me2的脱甲基化实现的。
 
3PHF8沉默后,H3K9me1, H4K20me1, L3MBTL1表达增强
A: 针对PHF8启动转录区域的三个靶基因设计实时定量的各3对引物
其中第二个扩增子横跨PHF8的结合区域。
B: 质粒转染hela细胞后,进行染色体免疫共沉淀,富集的DNA片段进行实时定量PCR
PHF8被沉默以后,H4K20me1 and H3K9me1在扩增子2的区域表达增高、进一步证明了前面的结果
C: 实时定量检测:在hela细胞中PHF8被沉默以后,三个靶基因的表达情况。
及进行了相关的rescue实验
这些结果进一步证明了PHF8调控转录翻译通过对H4K20me1 and H3K9me1的去甲基化
 
4:PHF8基因在不同发育阶段斑马鱼中的表达,用原位杂交技术
 
14h在头部及尾部表达
从第一天开始主要在头部表达
在3天的斑马鱼的下颌骨也可以检测到PHF8的表达,箭头指向
 
 
5 PHF8在斑马鱼胚胎中调控大脑及颅面部发育
A:注射PHF8MO引起大脑发育延迟,24H.
B:注射PHF8MO出现明显的面部发育畸形,下颌骨明显缺失。
染色:1到5咽弓发育都不同程度的受到了影响。第一咽弓没有迁移到整个下颌骨的范围,第二咽弓反转,第3到第5咽弓发育欠佳畸形或缺失。
 
C:吖啶橙染色 注射PHF8MO30小时引起大脑与神经管的细胞凋亡,RESCUE 共同注射后效果好,共同注射无催化活性的PHF8时不能拯救即阴性对照。(引起的细胞的凋亡是通过直接调控凋亡机制?还是间接的通过调控细胞增殖引起的还不清楚),(推测可能与神经发育有重要的关系)
 
 
这些结果证明PHF8在斑马鱼的大脑及颅面部发育是非常重要的。这些取决于它的脱甲基酶活性。
 
 
Msx基因家族编码的转录因子参与TGFβ, BMP and WNT 信号通路的下游调控,并且在整个信号通路中发挥了非常重要的作用,已经证明在颅面部及神经发育过程中发挥着重要的作用。已经证实MSX1是PHF8直接目标靶基因,文中选用了MSXB进行相关研究发现可以拯救一部分虽然不能完全拯救。说明MSXB也是PHF8的一个靶基因
这个结果显示:PHF8控制颅面部及神经发育在某种程度上是通过调控MSXB的表达。
 
6:染色质免疫共沉淀测序及基因芯片技术
 
CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;
 
证明了许多与XLMR相关的基因都可能是PHF8的靶基因
图中列出一共90种与XLMR相关的基因,左侧列出的是与非综合征型XLMR相关的基因,右侧列出的是综合征型XLMR相关的基因。其中有40种红色标记的可能是PHF8的直接靶基因。
Nature. 2010 July 22; 466(7305): 503–507. doi:10.1038/nature09261
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