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口腔罕见病与遗传病网是针对一些罕见口腔疾病、未确诊的疑难和复杂性口腔疾病、以及遗传性口腔疾病提供医疗咨询或科普宣传的公益性网站。遗传性的口腔颌面部疾病种类繁多,可单发于牙、口腔、颌面和颅面等,或作为全身疾病的局部表型而存在。目前国内外关于罕见口腔疾病和遗传性口腔疾病的信息量相对较少,本网站聘请了一些国内外知名专家,免 [详细>>]
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第四军医大学口腔医院口腔遗传病门诊
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口腔遗传性疾病系列讲座(四)
(2016/8/26) 浏览人数: 768
                                                                     口腔单基因遗传病与罕见病的遗传研究策略
                                       Genetic research strategies of oral monogenic diseases and rare diseases
                                                                                                 段小红
       在口腔临床实践过程中,口腔科医师会碰到一些有着明确家族史的单基因遗传病,以及一些具有鲜明临床表型特征但并不清楚其与遗传因素是否有关的罕见疾病,如何收集这些病例并开展相关的遗传学研究,不仅仅是一个科学研究相关问题,也必将为这些疾病的正确诊断和个性化治疗提供重要参考。
       回顾近30年《中华口腔医学杂志》以及J Dent Res(《牙科学研究杂志》)发表的关于口腔单基因遗传性疾病的数十篇论文,笔者发现,这些文章有以下特点:①病例报道居多,特别是中文论文;②所报道的疾病多为已知的单基因遗传性疾病;③研究内容主要涉及已知基因新突变报道、已知单基因遗传病新的表型特征的描述或文献回顾,以及已知单基因遗传病新候选基因的报道,最后一类文章寥寥无几。据此笔者建议采取以下遗传研究策略展开口腔罕见疾病和口腔颌面单基因遗传性疾病的科学研究,期望我国口腔医学工作者能够发现新的口腔遗传性疾病或者发现某些口腔遗传性疾病的新致病基因。
一、    口腔罕见疾病与遗传
1.罕见病的基本概念和现状:罕见病是发病率极低的疾病。世界卫生组织将罕见病定义为患病人数占总人口的0.65‰~1‰的疾病或病变;欧洲学者认为发病率低于1/2 000的疾病属于罕见病;美国学者则认为每年患病人数少于20万人(或发病人口比例小于1/1 500)的疾病;日本学者认为罕见病为患病人数少于5万(或发病人口比例为1/2 500)的疾病。目前我国尚无官方的关于罕见病的权威定义,我国台湾地区学者以低于万分之一发病率作为罕见病的标准,大陆学者认为成人患病率低于五十万分之一,新生儿发病率低于万分之一的疾病为罕见病。
       目前已知的罕见病六千余种,约80%由遗传因素所致;罕见病其他致病原因包括感染、过敏、环境因素、退行性或增殖性病变;约50%的罕见病在儿童期可表现出来。某些特定罕见病通常是“无国籍”的,全世界所有罹患该病的患者可能只有数百人,或者更少。然而,总体上罕见病约占人类疾病的10%,按此比例,我国各类罕见病患者总数应有千万人之多,因此罕见病并不“罕见”。
       目前国内对罕见病的研究和治疗仍处于初始阶段,研究罕见疾病的机构很少,缺乏能够全面正确诊断的专业人员。大部分罕见病患者长期被误诊和漏诊,得不到及时有效的治疗。相关药品研发起步晚,约1%的罕见病有有效治疗药物。相对于众多的罕见病患者,罕见病的政策制定、医疗保险、诊断标准、治疗药物和方法等多方面存在明显的空白或不足。
2.口腔罕见病:口腔罕见病约占罕见病总数的10% ~ 15%,包括在口腔颌面单独发生的罕见病以及伴随有口腔颅颌面表现的罕见病。常见的口腔罕见病包括乳光牙、无根牙,多生牙、各种面裂疾病、颌骨畸形、舌和口腔黏膜及牙周特殊病变等。口腔罕见病因其特殊位置较易被患者或周围人发现,口腔罕见病会引起咀嚼、吞咽、言语等功能障碍,同时因其畸形特征,患者易被歧视而产生自卑心理。
3.口腔罕见疾病遗传研究中的注意事项:首先正确诊断罕见病,确定其是否为已知的综合征、染色体病、遗传性代谢病。一些口腔医师因为知识的局限,把一些在国内或国际期刊或书籍已经报道过的疾病当作一种新疾病,因此应该有效利用纸质文献、在线数据库、同行或专家咨询等途径,确定疾病的性质和归类。
       在明确口腔罕见病的类型后,应分析该病与遗传的关系,确定是染色体病、单基因遗传病还是多基因遗传病,不同类型的遗传性疾病的研究策略存在很大差别,决定了未来遗传研究的手段、经费和人力投入等。
       罕见病研究过程中的难点在于散发病例的研究,有些散发病例与遗传无直接关系,可能因病毒感染、免疫调控异常、肿瘤,甚至一些外因所致,应避免把罕见病不加选择地纳入遗传学研究。
       仔细询问家族史对遗传性疾病的确诊十分重要,如家系中每代均有患者,呈现代代相传的特征,应考虑显性遗传的特征。
       有些看似散发的罕见病例实际属于隐性遗传,通常一个家系中只有先证者表现出临床症状,其他成员并无相似临床表型,这一特点在一些核心家庭或主干家庭中更为明显,有些父母非常困惑为何自己看似健康但其子女却患遗传病。这种情况下,应根据病症的临床表现为患者做出初步的临床诊断,确定疾病是否存在隐性遗传的可能性,必要时行二代测序,通过生物信息学的方法最终判断先证者与其父母的遗传关系及可能存在的候选基因。
       在口腔罕见病的诊治过程中应注意完整资料的收集和保存。病例研究是口腔罕见病的一项重要内容,口腔医师应该注意收集完整的临床资料,这一观点应该贯彻至口腔罕见病的诊治全程,从开始询问病史、临床检查、家系调查、临床检验和检查、治疗方案确定与实施、病例回访与复查等。本系列讲座的第一讲中已强调,很多口腔疾病或临床表现是综合征的局部表现,因此在资料收集时,口腔医师不应将眼光局限于口腔颌面特征,要对患者的全身症状仔细检查,避免因某些临床特征的疏漏而造成误诊。
       另外,在诊治过程中要注意各类样本的收集,如患者脱落的牙齿、唾液、血液、龈沟液、牙龈组织、各种手术切除物等,收集过程应符合相应的伦理道德要求和患者知情同意[3]。根据研究目的不同,从以上组织中提取DNA、RNA或蛋白样本,或者进行组织培养或细胞培养,这些疾病的罕见特性决定了其样本的稀有特征,应珍惜样本,进行长久而系统管理,避免由于研究者个人因素造成样本丢失、混用等。
       第四军医大学口腔医学院于2011年建立了国内首个口腔罕见病与遗传病生物样本库,采用了目前国际通用的生物样本库(biobank)规范化管理方式,标准化收集、处理、储存和应用各种样本,对这些生物样本相关的临床、病理、治疗、随访、知情同意等资料进行系统的质量控制、信息管理与应用。样本库的建立为系统研究口腔罕见病与遗传病提供了基础,也为不同研究个体或实验室之间的合作奠定了基础。
二、口腔单基因遗传性疾病的研究策略
       每一口腔遗传病病例都有其独特的研究价值,其研究结果能否有效展示取决于诸多因素,如完整而全面的临床资料、必要的临床检验、正确的临床诊断、详尽的家系资料、基因分析等。现从已知的口腔遗传性疾病、新的口腔遗传性疾病两个角度讲述研究策略。
1.已知口腔遗传性疾病的研究策略:
(1)正确诊断:研究已知口腔遗传性疾病的前提是正确诊断。在口腔临床中遇到的多数遗传病例都曾被报道过,这些内容发表在相关的中英文书籍、学术期刊、在线数据库等,选择正确的检索路径,不难对这些疾病正确诊断。
       很多口腔遗传性疾病不能被正确、及时诊断主要原因如下:①遗传疾病背景知识局限或欠缺,不认识这些遗传性疾病;②口腔遗传性疾病种类繁多,一些遗传性疾病的发病率为几万分之一甚至几十万分之一,全世界罹患该疾病的患者极少,能够正确诊断这些疾病的临床专家、疾病的普及知识十分匮乏;③临床表型复杂多样,多数口腔遗传性疾病伴随其他组织或器官的异常或功能障碍,有些是全身性遗传疾病的口腔颌面局部表现,忽略全身症状会影响对疾病本身的诊断;④遗传性疾病致病机制复杂,同一疾病、同一致病基因、同一位点的突变可能在不同患者有着不同的临床表现,以上这些均影响遗传性疾病的正确诊断。
(2)明确候选基因:对已知口腔遗传性疾病进行研究的第二个环节是基因检测,以确定候选致病基因。确定的途径包括借助相应的书籍、学术期刊、各种数据库和软件寻找关联信息,必要时与国内外专业实验室和该领域的专家联系、咨询,从而明确某口腔遗传性疾病的候选致病基因,了解该疾病是一种候选致病基因,还是多个候选致病基因,多个候选基因突变所造成的临床表型有无差异。
       针对以往文献报道的候选致病基因,应了解该基因在这一口腔遗传性疾病患者中的检出率、是否为公认的候选基因、以往报道的基因突变是否进行了功能验证,一些基因是否存在热点突变区,其不同的突变位点是否与特定的临床表型相关联,不同人种或民族在同一基因的突变热点是否有差异。
(3)确定基因变异的位置:当确定候选基因后,以患者的基因组DNA为模板,针对候选基因全长或部分设计特异引物,进行PCR扩增和测序,最终的序列与数据库比对,判断是否有突变,PCR是基因鉴定的金标准。
       当报道某些基因突变位点时,一定要客观和准确,要明确该突变位点是否与某种类型的遗传病相关,这些突变是否致病或有害。许多中英文报道中遗传性病例涉及某候选基因的突变,但研究也以此结束。尽管很多期刊要求作者在50例甚至100例正常对照验证该突变位点,以排除基因多态性的可能性,但仅有这些还是不够的。
       最近一项104名个体测序发现的406个基因变异中,122个(27%)变异属于常见的多态性,缺少具有致病性的直接证据[4]。2014年《自然遗传》杂志发表的一篇权威综述认为,在人群中发生比例小于1%的基因变异才是真正意义上的变异,作者将基因变异分为以下几种类型:①致病型(pathogenic),基因变异参与疾病的发生,但不完全外显(即其单独不一定能致病);②潜在型(implicated),基因变异只在某个特定条件下具有一定的致病性;③关联型(associated),疾病组的基因变异发生率明显高于对照组;④破坏型(damaging),基因变异可改变基因或基因产物的正常表达水平或生物化学功能;⑤有害型(deleterious),基因变异可降低携带者的生殖健康,使其易通过自然选择而被淘汰[5]。
       一般有研究意义的基因变异是指那些参与严重单基因遗传病的主要变异以及复杂疾病中少见、但具有广泛效应的危险变异。
2.新的致病基因或新的口腔遗传性疾病的研究策略:见图1。
(1)选择合适的检测方法筛选候选基因:随着医学遗传学、基因组学、生物信息学技术的迅猛发展,涌现了多种基因检测技术方法,如全基因组测序(full genome sequencing,FGS;whole genome sequencing,WGS)、全基因组重测序(whole genome re-sequencing)、外显子组测序技术(exome analysis)、全转录组测序(whole transcriptome sequencing;RNA-seq;whole transcriptome shotgun sequencing,WTSS)、SNP芯片(SNP chip;SNP microarrays)等,这些技术帮助研究者缩短发现新基因的时间,同时将大量的基因数据呈现出来。
       目前验证单基因遗传的首选方法是外显子组测序技术。外显子组是指全部外显子区域的集合,该区域包含合成蛋白质所需的重要信息,涵盖与个体表型相关的大部分功能性变异。外显子组测序采用外显子组序列捕获及二代测序技术,只针对外显子区域的DNA,其覆盖度更深、数据准确性更高,具有简便、经济、高效特征。结合大量的公共数据库提供的外显子数据能较好地解释相关研究结果。通过外显子组测序技术通常可发现一些罕见的、高外显的、参与蛋白编码的变异。
       经典的遗传学研究方法如细胞分子遗传学方法、连锁分析在协助分析拷贝数变异、大的孟德尔疾病家系(特别是显性)共分离的单倍型等方面十分重要。
       在大数据的初筛基础之上,必须要通过经典的Sanger测序验证二代测序等方法筛选到的基因变异的真伪。
(2)候选新基因及其基因变异的生物信息学分析:外显子组测序获得大数据后,选中与疾病直接相关的候选基因,这是一项复杂、具有挑战性、判断遗传知识、生物学知识和医学知识综合应用能力的过程。
       应通过生物信息学的方法和文献检索对初步筛选基因的基本特性、编码信息、突变位点的保守性、基因进化特征、以往文献对该基因功能的描述、突变后功能预期等进行全面分析,判断哪个基因与该疾病的关联更为密切。对于未曾报道过的疾病和未曾深入研究的基因,需要从和该疾病有着近似临床表型特征的其他疾病入手,参照其研究思路或机制,或参考新基因关联基因的功能判断候选基因。
       对于假定的单基因遗传病应增加具有相似临床特征的家庭个数将有利于新基因的发现。对于无家族史的单个先证者,研究者应对无症状先证者的父母进行基因检测和分析,提高发现新突变和复合杂合突变的类型。
(3)候选新基因的功能验证:在遗传学研究中一个十分重要的研究内容就是验证新基因功能及其变异。可以从以下几个层面开展研究。
       首先,基于患者的组织或细胞开展的相关研究,其优势在于患者的组织或细胞自身就表达突变蛋白或基因变异使蛋白低表达或不表达,因此是研究新基因功能的一个好模型。例如,可以对牙根发育不全的牙进行组织学分析,观察其对应的牙冠和牙根的组织和细胞特征,判断新基因可能影响的部位;也可从患牙分离干细胞、比较干细胞在不同定向分化过程中的差异,从而判断新基因主要影响哪些主干细胞的分化通路;必要时可行拯救实验,将患者来源的细胞再次转染野生型基因,如果其功能恢复,则是对缺陷功能的直接验证。
       第二,体外相关实验,即克隆新基因及其变异体,在真核或原核细胞表达这些蛋白,观察其表达特征,有无数量、降解特性和生物学活性的改变。可采用基因沉默的方法降低特定细胞内源性基因表达的方法,观察细胞生物学特性的改变。新基因可能存在一定的关联蛋白,也可能是某些信号通路中的重要分子,因此也需检测其相应的上游或下游分子或基因产物的变化特征。
       第三,模式生物研究,遗传学研究的经典模式生物研究涉及酵母、果蝇、线虫、斑马鱼、小鼠等。在口腔遗传性疾病的模式生物研究中,除小鼠外,其他几种模式生物方法也适合研究口腔颌面疾病,事实上,这些模式生物研究的方法各有优缺点,要根据研究的基因和疾病的临床表型特征综合判断采用哪种模式生物方法更适宜。笔者在前期研究中发现,斑马鱼2~45 d的颅骨发育表现出特定的时空特征,非常适宜研究颅骨的生长发育或建立特定的颅颌面疾病研究模型,可针对其程序化骨化的时间、次序、骨化程度的改变分析影响颅骨发育的重要因素[6]。此外,斑马鱼的牙发育周期短,也适宜研究某些牙遗传性疾病。
       综上所述,口腔罕见病和单基因遗传病的研究是一个漫长的过程,需要一定的策略,才能最终把与遗传疾病相关的新基因展示出来。
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